Dinámica genético-molecular de impacto ambiental en especies tropicales


Metales Pesados
Comparative studies of toxic stress induced Cu, Pb, and Cd in tropical plants

Rosalinda Aybar Batista, B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

Exposition of plants to heavy metals causes diverse biochemical and molecular changes depending on the kind of metal, concentration, and response of the plant to avoid toxicity. Oxidative stress due to heavy metal toxicity, produces reactive oxygen species which interfere many metabolic pathways and genomic stability. The homeostatic mechanisms responsible in plants to handle the stress induced by heavy metals is not clearly defined. This knowledge is important for the implantation of applications such as the potential use of tolerant crops for fortification of food with essential metals and the use of plants to remediate polluted environments. The main purpose of this work is to study the response of tropical plants toward different heavy metals. Toxic stress induced by Cu, Pb, and Cd were studied on plant growth, chlorophyll content, free proline content, antioxidant activity of flavonoids, and metallothionein expression (MT2B gene). Clones of the tropical plant Bryophyllum pinnatum were cultivated in vitro in MS basal media that contained the heavy metal in triplicates. Part of the plant was used for total RNA isolation and converted to cDNA by reverse transcriptase. The cDNA was used as template for the expression analysis. The level of expression of MT2B gene was measured using Real Time Quantative PCR. The rest of the plant was used for assay metal content by Flame Atomic Absorption Spectrophotometry. Results indicate a correlation between the concentration and the toxic nature of the heavy metal and the level of stress response. The accumulation of metals elicited an anti-oxidative response, depending of type of metal, as demonstrated by the relative expression of MT2B gene, free proline, and flavonoid content.

Marcadores moleculares
Agonostomus monticola as an indicator of metal pollution in Puerto Rico’s rivers by means of molecular strategies.

Antonio E. Carro Anzalotta, M.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

This project is designed to assess the presence of pollutants in Puerto Rico’s streams using molecular methods in a common widely distributed native fish species (Agonostomus monticola). The aim of the study is to relate metalothionein metabolism in fish as a response to water pollution. For this purpose we will study the expression of metalothioneins in specimens of A. monticola using ELISA, PCR, and Antigen-Antibody techniques. A. monticola is a native species commonly found in most of Puerto Rico’s streams which makes this species a good indicator of environmental health. The fishes will be captured from wild populations and acclimated to laboratory conditions at Barranquitas Campus of the Interamerican University (Biotechnology Building). This project is expected to set the base for further molecular research using fishes as indicators in environmental issues.

Estomas
El cierre de los estomas está relacionado cuando la actina se une a la proteína 1El efecto del cadmio en la expresión genética en los estomas de la planta de Arabidpsis thaliana

Yalexa Hernández Miranda, B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

SCAB1 es una proteína que recientemente ha sido descrita en la literatura científica por su habilidad de enlazarse a la proteína de actina en las plantas. Permite el empaque y la estabilización de filamentos de actina, regulando así el movimiento del estoma en la planta Arabidopsis thaliana. Los estomas son estructuras que regulan el intercambio de gas en las hojas con la atmósfera, permitiendo así la entrada de CO2 para promover la fotosíntesis. El propósito de esta investigación es entender el posible rol de SCAB1 en el abrir y cerrar de los estomas de la planta A. thaliana ante la ausencia y presencia de cadmio. Procedimos a llevar a cabo un estudio bioinformático para accesar e identificar secuencias de oligonucleótidos específicos para la amplificación de la proteína SCAB1. Los oligonucleótidos fueron usados para realizar análisis de PCR. Dos moldes de ADN fueron utilizados; un cADN se obtuvo del total de ADN aislado de A. thaliana expuesto y no expuesto a cadmio, mientras el otro fue aislado del estoma de la planta expuesta y no expuesta a cadmio. Los productos de amplificación que se esperaban, fueron obtenidos. Estos resultados indican la expresión de SCAB1, tanto en la planta total como en el estoma. Experimento adicionales se requieren para establecer una relacción entre SCAB1 y el abrir y cerrar de los estomas en las plantas expuestas a cadmio.

Kariana A. Feliciano López, B.S.
Nicole L. Rosendo Mercado, B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

Los estomas son estructuras en las hojas de las plantas que regulan el intercambio de gases con la atmósfera, jugando así un papel importante en el ecosistema. Se ha demostrado que el mecanismo de apertura y cierre de los estomas está regulada por procesos físicos y químicos, así como hormonas. En la actualidad, muchos genes están implicados en la regulación de los procesos biológicos de los estomas, por ejemplo, en trabajos previos se ha demostrado la presencia de las proteínas contráctiles (actina y miosina) mediante inmunofluorescencia indirecta. En este proyecto, el objetivo es verificar la expresión de ciertos genes que están presentes en los estomas mediante herramientas moleculares (RT-PCR) y técnicas analíticas (HPLC). Además, se estará observando el efecto del cadmio en la expresión de los genes de los estomas y de la planta Arabidopsis thaliana.

 

Biodiversidad

Sistemática molecular

Caracterización molecular y análisis sexual del camarón almeja

Keila M. Avilés López, B.S.
José C. Rivera García, B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

El género Eulimnadia es un crustáceo de la familia Limnadiidae, también conocido como camarón almeja. Es una especie inusual y una de las más antiguas, teniendo androdioecia (mezcla de machos y hermafroditas). Estas características hacen que Eulimnadia sea considerado un organismo importante, cuyas relaciones evolutivas han sido cuestionadas por la comunidad científica durante décadas. En esta investigación se estudió Eulimnadia, de un estanque localizado en el pueblo de Cayey, Puerto Rico, que tiene muchas similitudes con Eulimnadia texana. Un hábitat artificial se ha establecido para el crecimiento óptimo de esta especie, en la que se han probado diferentes condiciones ambientales. En este momento estamos tratando de establecer si la especie de Puerto Rico es en realidad Eulimnadia texana o una nueva especie. Además de la caracterización morfológica, estamos utilizando como criterios de identificación el gen COI (citocromo c oxidasa subunidad I). Se aisló el ADN del camarón almeja de Puerto Rico y un segmento del gen COI se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los resultados se han analizado y comparado, para determinar si se está trabajando con Eulimnadia texana o se trata de una nueva especie.

Epigenética
Efectos del Cadmio sobre la epigenética de genes del citoesqueleto en células CHOEpigenética y Homeostasis de metales pesados en Arabidopsis Thaliana

Idalisse Colón Rodríguez, B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

Cadmio es un contaminante ambiental que causa daños en la célula. El término epigénetica, se refiere a cambios en la expresión de genes que no envuelvan cambios en la secuencia de bases del ADN, sino más bien a las alteraciones del ADN por metilación e histonas. Este estudio tiene como enfoque el investigar la epigenética de los genes citoesqueletales en cultivos de células CHO ante la exposición a cadmio. En particular, nos interesa investigar la epigenética de actina y miosina ante la exposición de altas condiciones tóxicas. La epigenética asociada a metilación del ADN en células expuestas y no expuestas a cadmio fue comparada. Para determinar cambios epigenéticos en estas células se utilizó medidas de los niveles de metilación según provistos por el “Melting Curve Analysis”. El ADN genómico fue aislado y convertido por la reacción de bisulfato. Análisis de bioinformática se utilizó para desarrollar cebadores específicos para el promotor de la región de actina y miosina de células CHO. Los resultados están en progreso para determinar si estos genes son epigenéticamente afectados o no ante la presencia de cadmio.

Idalisse Colón Rodríguez, B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

Los mARN son moléculas de ARN no codificantes de 21-23 nucleótidos de largo, han demostrado tener efectos regulatorios en la expreción de los genes. El propósito central de esta investigación es el estudiar la expresión de miARN en la planta de Arabidopsis thaliana cuando es expuesta a cadmio. Cadmio es un metal altamente tóxico para la mayoría de las plantas, animales y al ser humano. Nosotros en esta investigación queremos analizar la posible relación entre los ARN no codificantes y la respuesta de la planta, al estrés inducido por metales pesados. Los cultivos in vitro de Arabidopsis thaliana expuestas a cadmio, el total de ARN fue extraído, y separado en una gel de poliacrilamida desnaturalizante. Las bandas correspondientes a el tamaño esperado de miARN fueron cortadas y extraídas. Los concatámeros fueron convertidos a cADN y clonados en un vector apropiado. Al secuenciar los clones generados, varios miARN fueron identificados, tales como osa-miR-1425-5p. Estudios futuros son necesarios para establecer una relación clara entre esos miARN y la respuesta de la planta al ser expuesta a estrés inducido por cadmio.

Cáncer

Bryophyllum pinnatum, propiedades médicas en células cancerosasPerfil de metilación de regiones promotoras de los genes APC, CACNA1G, CDKN2A, DDC, MLH1 y MSH2 y su correlación al cáncer colorrectal en pacientes del área central de Puerto Rico

Luis A. Estrella Matos, B.S.
Jennifer Sánchez Maldonado, B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

La incidencia de cáncer en la población de Puerto Rico ha sido alarmante en las últimas décadas, siendo el cáncer colorrectal la causa principal de esta enfermedad. La biotecnología, en conjunto con la medicina, tienen un gran reto para combatir esta enfermedad utilizando varias drogas que resultan invasivas para el paciente. Es importante explorar métodos alternos para enfrentar esta enfermedad. Bryophyllum pinnatum es una planta medicinal comúnmente utilizada como medicina tradicional para curar varias infecciones, enfermedades intestinales, curar heridas y otras condiciones. No obstante, sus propiedades anti-cancerígenas han sido poco definidas. En vista del amplio espectro de potencial terapéutico de Bryophyllum pinnaum y la ausencia de terapias anti-cancerígenas para la prevención y el tratamiento de cancer colorrectal, en este estudio examinaremos las propiedades anti-cancerígenas en sus extractos de hoja. Utilizando cuatro homogenados de extractos de hojas de Bryophyllum pinnatum con etil acetato, acetona, cloroformo y metanol/cloroformo, examinaremos el efecto inhibitorio de estos extractos de hoja con diferentes solventes en líneas celulares de cáncer colorrectal (HCT-116 de ATCC@). Para medir el efecto inhibitorio, usaremos 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyl tetrazolium bromide (MTT). Este ensayo de MTT está basado en la conversión de MTT a cristales que se formarán en células vivas, lo cual determina actividad mitocondrial. Como en la mayoría de las poblaciones celulares, la actividad mitocondrial se relaciona con el número de células viables, para determinar cuál componente del extracto es el responsable del efecto inhibitorio, utilizaremos espectroscopía UV, visible e infraroja y cromatografía de gas. Por ende, esperamos que nuestro estudio demuestre la presencia de propiedades anti-cancerígenas en las hojas de Bryophyllum pinnatum que pueden ser luego investigadas como agentes potencialmente anti-cancerígenos.

Anarilis Negrón Santini, B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

El cáncer colorrectal es una de las causas principales de muerte mundialmente. Resulta de la acumulación de cambios genéticos y epigenéticos en células epiteliales del colon que las transforman en adenocarcinomas. En la última década, ha habido avances mayores en nuestro entendimiento acerca de la epigenética del cáncer, particularmente aquellos cambios relacionados a aberraciones en la metilación del ADN. La metilación del ADN consiste en la adición enzimática de un grupo metyl a la porción-5 de cisteína por metiltransferasas del ADN (DNMT) para producir 5-metylcitosina, una fase normal en el ADN. Generalmente, el sustrato favorecido por el DNMT es una secuencia de dinucleótido de CG, la cual ha sido catalogada como “CpG”. La mayoría de los CpGs son metilados en células mamíferas normales, mientras que “CpGs” no metiladas están sólo presentes en regiones de ADN llamadas “islas de CpG”. Las islas de CpG son regularmente definidas como secuencias mayores de 200-500 bases en longitud con un contenido de GC mayor de 50% y un radio de CpG esperado mayor de 0.6. Estos sobrelapan la región promotora de 60%-70% de genes, y tienden a estar protegidos de la metilación; no obstante, pueden llegar a ser metilados en cáncer. La metilación de islas de CpG dentro de la región promotora se correlaciona con el silenciamiento transcripcional, y es asociado a un subgrupo de genes metilados en cáncer colorrectal. Los patrones globales de la metilación del ADN en cáncer colorectal están alterados, mostrando hipometilación global de regiones intergénicas ricas en repeticiones e hipermetilación de regiones ricas en CG en el promotor de la secuencia del gen o en las islas CpG, como resultado de la represión trenscripcional de genes supresores de tumor. El enfoque principal de este estudio es determinar un perfil de metilación al evaluar el porcentaje de metilación de islas CpG en regiones promotoras de los siguientes genes asociados a cancer colorrectal (incluidos en los 750 pares de bases “upstream”); APC, CACNA1G, CDKN2A, DDC, MLH1 y MSH2. Específicamente, la represión de estos genes está implicada en la proliferación celular de células de cáncer colorrectal. Tratamiento de bisulfato de sodio del ADN y subsiguiente cuantificación de la metilacion del ADN mediante el análisis de la gráfica “melt curve” utilizando la técnica de RT-PCR se llevará a cabo con el objetivo de cuantificar la metilación en la linea celular de cáncer del colon, HCP116, y en células de colon normal, CRL125. Esperamos que la hipermetilación de las regiones promotoras de estos genes resulten en la inhibición de su transcripción, induciendo así la proliferación no-regulada de células del colon. Las aplicaciones clínicas de alteraciones epigenéticas están basadas en el uso de estas regiones promotoras específicas como marcadores moleculares para propósitos de prevención y tratamiento del cáncer colorrectal.

Estrés ambiental

Efectos del Cadmio sobre la epigenética de genes del citoesqueleto en células CHO

Idalisse Colón Rodríguez, B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

Cadmio es un contaminante ambiental que causa daños en la célula. El término epigénetica, se refiere a cambios en la expresión de genes que no envuelvan cambios en la secuencia de bases del ADN, sino más bien a las alteraciones del ADN por metilación e histonas. Este estudio tiene como enfoque el investigar la epigenética de los genes citoesqueletales en cultivos de células CHO ante la exposición a cadmio. En particular, nos interesa investigar la epigenética de actina y miosina ante la exposición de altas condiciones tóxicas. La epigenética asociada a metilación del ADN en células expuestas y no expuestas a cadmio fue comparada. Para determinar cambios epigenéticos en estas células se utilizó medidas de los niveles de metilación según provistos por el “Melting Curve Analysis”. El ADN genómico fue aislado y convertido por la reacción de bisulfato. Análisis de bioinformática se utilizó para desarrollar cebadores específicos para el promotor de la región de actina y miosina de células CHO. Los resultados están en progreso para determinar si estos genes son epigenéticamente afectados o no ante la presencia de cadmio.

miARN

Epigenética y Homeostasis de metales pesados en Arabidopsis thaliana

Alba L. Marrero Rodríguez B.S.
Juan A. Negrón Berríos, Ph.D.
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto de Barranquitas

Los miARN son moléculas de ARN de entre 21-23 nucleótidos de largo que han demostrado tener funciones reguladoras en la expresión genética. El propósito fundamental de esta investigación es estudiar la expresión de los miARN en Arabidopsis thaliana al ser expuesta a cadmio. El cadmio es un metal pesado altamente tóxico para la mayoría de las plantas, animales y el ser humano. Se pretende entonces, analizar la posible relación entre estas moléculas de ARN no codificante y la respuesta a estrés de la planta, inducida por metales pesados. Cultivos in vitro de A. thaliana fueron expuestos a cadmio, de los cuales se extrajo el ARN de planta total y se separaron los fragmentos de bajo peso molecular correspondientes al tamaño esperado de los miARN en una gel desnaturalizante de poliacrilamida con urea. Se sintetizó cADN a partir de los fragmentos aislados y se realizó una ligación en serie para insertar distintos fragmentos en un vector de expresión. Mediante la secuenciación de los clones generados se identificaron diferentes miARN como el osa- miR -1425 -5p. Estudios complementarios deben ser realizados para establecer una relación clara entre estos miARN y la respuesta de la planta al estrés inducido por cadmio.