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RESUMEN

El camarón almeja es un organismo distribuidoampliamente alrededor del mundo. A pesar de serun organismo tan común, su genoma aún no se conoce. Al presente, se ha secuenciado una diversidad de genes y fragmentos de DNA presentes en los mismos. Dichas secuencias de genes y de fragmentos de DNA, sirvieron como base para la realización de este trabajo. El enfoque del mismo era identificar y caracterizar, genética y molecularmente, una especie de camarón almeja que habita en un estanque efímero en el pueblode Cayey, Puerto Rico. El suelo del estanque fuemuestreado siguiendo el trabajo de Hollenbeck, et. al.2001. Se establecieron las condiciones para eclosionar los huevos y hacer crecer los camarones almeja en el laboratorio. Distintas etapas de crecimiento del camarón almeja fueron estudiadas morfológicamente y los hallazgos fueron comparados con los trabajos de Erich Eder, (2002) y de J. Olesen, et. al. (1996, 2003).Preliminarmente se identificó el camarón almeja que habita este estanque como miembro de la familia Limnadiidae.

El gen que codifica para la proteína Elongation Factor-1 alpha está presente en camarones almeja miembros de la familia Limnadiidae. Por consiguiente, se diseñaron oligonucleótidos para amplificar laproteína Elongation Factor-1alpha. Adicionalmente, se utilizaron los oligonucleótidos diseñados por Parky O’Foighil, (2000) para amplificar un fragmento de DNA ribosomal. Se extrajo el RNA del camarón almeja objeto de estudio y por razón de transcripción reversase convirtió en cDNA. Utilizando los oligonucleótidos ya mencionados mediante la reacción de polimerasaen cadena se amplificó el gen de la proteína Elongation Factor-1 alpha y un fragmento de DNA ribosomal.

La etapa final de este trabajo consistirá de la clonación de estos fragmentos en bacterias, para luegoser secuenciados. Un análisis genético de los mismos nos asistirá en la clasificación de nuestro organismo. Habiendo realizado esto podremos dar inicio y validar futuros trabajos de investigación utilizando esta especie de camarón almeja.

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Esta investigación tiene como objetivo identificarla presencia de las Actinas, Miosinas y Metalotioneínas en un extracto total de proteínas de la planta Arabidopsis thaliana. Las Actinas son proteínas globulares relacionadas a la motilidad, morfología y contracción celular. Por otro lado, las Metalotioneínas(MT’s) tienen la capacidad de unirse a metales pesados y han servido como biomarcadores específicos para la exposición de metales. Por último, las Miosinas son proteínas contráctiles que además de encontrarse en el tejido muscular, abundan en el citoesqueleto, realizando una variedad de funciones asociadas a la motilidad celular.

En este trabajo se ha obtenido un extracto de proteínas, el cual fue clarificado utilizando ultra centrifugación a 100,000rpm. Se analizaron las proteínas mediante SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) y WesternBlot, en el que utilizamos anticuerpos obtenidos  para ser analizados mediante la técnica deElectroforesis Capilar.

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Las metalotioneínas son de gran importancia ya que éstas se encuentran asociadas a la asimilación de metales pesados en las plantas. Por consiguiente, es degran interés conocer si la Metalotioneína 2b (MT2b) es responsable de este proceso en las plantas. Por consiguiente, se utilizó la planta Arabidopsis thalianacomo modelo de estudio de la MT2b, la cual ha sido secuenciada. Se diseñaron oligos para amplificar el fragmento de interés (MT2b) de la planta modelo.El resultado del PCR analizado por electroforesis, fue aislado y purificado para realizar posteriormente ligación en el plásmido pGLO, transformación de bacterias E. coli DH5α y finalmente, secuenciación.

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Los estomas son estructuras especializadas de las plantas que facilitan entre otras cosas, el intercambio de gases con el medio ambiente. El movimiento de los estomas no está claramente definido. En este trabajo se trató de establecer una relación entre los estomas y proteínas contráctiles tradicionalmente asociadas al citoesqueleto. Elcitoesqueleto es una red tridimensional interconectada de microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios, que confiere estructura al citoplasma de una célula eucariota, e interviene en los movimientos celulares. El mismo contiene unas proteínas accesorias que determinan las funciones fundamentales de la actina y que están implicadas en procesos de andamiaje y dinámicas de movimiento. Un ejemplo de estructuras relacionadas al movimiento, son los estomas, encontrados en la epidermis de las hojas de las plantas. Los mismos de limitan un orificio llamado ostiolo, que se abre cuando estás se hinchan con agua procedente de las células epidérmicas anexas. Analizar proteínas contráctiles asociadas al mecanismo de contracción de los estomas es útil para entender como las plantas pueden adaptarse en situaciones de sequía, controlando la pérdida de agua. Es por ello que en esta investigación se pretende visualizar los estomas, y su posible co-localización con proteínas contráctiles, mediante el método de inmunofluorescencia indirecta, en las hojas de Arabidopsis thaliana. En este trabajo se presenta dicha co-localización utilizando anticuerpos de anti actina (planta) 10-B3 y anti miosina XI.

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La micropropación de la planta Arabidopsis thaliana es importante en nuestro laboratorio como control para estudios de fitorremediación y estudios genético moleculares. En el laboratorio se han generado plántulas de Arabidopsis thaliana utilizando semillas, pero la variabilidad genética presenta un problema estadísticamente significativo. Es por ello, que estamos realizando cultivo in vitro utilizando fragmentos estériles provenientes de la hoja de Arabidopsis thaliana. Estos estudios permiten desarrollar una progenie de plántulas con el mismo genotipo. La fase inicial de esta experimentación fue tomar fragmentos de una planta estéril, desarrollada a partir de semillas, y cultivarlos en el medio Murashige and Skoog (MS) con diferente concentración de la hormona ácido índole acético (IAA) para observar su desarrollo. Con estos resultados de cultivo de tejido se han iniciado ensayos de fitorremediación. Para realizar los mismos se desinfectaron semillas Arabidopsis thaliana y se expusieron las mismas a MS con 10ppm (10mg/L) y 100ppm (100mg/L) de plomo, para observar el efecto del metal en la germinación y el crecimiento. Los resultados preliminares mostraron que existe una retardación en la germinación de las semillas de 1 día. Además de esto, se estuvo calibrando la Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR), para la amplificación de los genes de metalotioneínas 2b, miosina XI y actina I,para ensayos futuros.

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Esta investigación pretende desarrollar un perfil de los genes implicados en la supresión de tumores en el cáncer colon-rectal (CCR) en muestras de personas de Puerto Rico que han fallecido de la enfermedad. Dicho perfil se concentrará en cambios epigenéticos,como es el caso de la metilación de regiones promotoras de estos genes. Por tanto, se desea el estudio de la expresión de 24 genes asociados al cáncer colon-rectal. Estos genes se han analizado mediante el uso de Reacción de Polimerasa en Cadena en TiempoReal (RTq-PCR). Hemos calibrado la extracción de DNA en cuanto a óptimo rendimiento y pureza que nos permita determinar el perfil de metilación de los genes estudiados mediante RTq-PCR. Se estableció el uso de una línea celular de cáncer de colon HCT-116 de ATCC como uno de los controles en RTq-PCR.

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Los cuerpos de agua son recursos naturales esenciales para un país. Debido a su vital uso e importancia en la salud pública, es fundamental la protección de los abastos de agua de la contaminación fecal. El objetivo principal de esta investigación es la determinación de la calidad de agua del segmento inicial de la Cuenca Hidrográfica del Río Grande de Manatí, por medio de pruebas microbiológicas, parámetros físico-químicos y sólidos disueltos y suspendidos. Luego del escogido de las estaciones de muestreo, la toma de muestras y el monitoreo de los parámetros físico-químicos, se llevó a cabo durante diez semanas. Para la determinación de contaminación microbiológica se utilizaron los coliformes como indicadores de contaminación fecal, según lo establecido por la Junta de Calidad Ambiental en Puerto Rico (JCA). La cantidad de unidades formadoras de colonias de coliformes, se determinó mediante el método de filtración por membrana utilizando el medio selectivo y diferencial m-ColiBlue24® de la compañía “Hach”, aprobado por la Agencia de Protección Ambiental (EPA). En el caso de la prueba para sólidos disueltos y suspendidos se utilizó el protocolo 2540 B “Total Solids Dried at 103-105°C” del “Standar Methods for Examination of Water and Wastewater”. Los resultados no revelaron alteración en cuanto a los parámetros físico-químicos y las pruebas de sólidos disueltos y suspendidos al compararlos con los Estándares de Calidad de Agua de la JCA. En cuanto a contaminación fecal se obtuvieron resultados fuera de los parámetros establecidos, esto solo en uno de los puntos de muestreo, por tanto, se recomienda realizar estudios especializados para analizar las fuentes de contaminación en el área.

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En este trabajo, utilizamos la planta Bryophyllum pinnatum como modelo para el estudio de las metalotioneínas (MT’s). Se diseñaron una serie de oligonucleótidos como herramientas que demostraron la presencia del gen de MT’s en la planta a través de la técnica de PCR. Los oligonucleótidos fueron diseñados utilizando secuencias nucleotídicas del gen de MT-2B en Arabidopsis thaliana, cuyo genoma ha sido secuenciado y se conoce que posee los genes de MT’s. El fragmento resultante del PCR analizado con una electroforesis fue aislado y ligado al plásmido pUC19. Este DNA posteriormente fue secuenciado y comparado con el gen de MT’s en A. thaliana, en la que se observaron las regiones de consenso en ambas especies.

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Los ecosistemas terrestres han sido alterados debido a la contaminación con metales pesados. En el intento por preservar nuestro ambiente, se han implantado una serie de técnicas convencionales para remediar áreas contaminadas con estos metales, pero las mismas son ineficientes y costosas. La fitorremediación es una alternativa potencialmente efectiva y ecológicamente viable. Su avance se ha retrasado debido, principalmente, a dos razones: 1) desconocimiento de los mecanismos de incorporación, movilización y metabolismo de estos metales en plantas, 2) falta de especies vegetales que puedan utilizarse como modelos de estudio y aplicación de acuerdo al ecosistema contaminado. Estas razones son la base para desarrollar una investigación con la especie tropical Bryophyllum pinnatum (conocida en Puerto Rico como Yerba Bruja), ampliamente distribuida en los ecosistemas tropicales y de escasa información científica. Con esta especie se desarrollará un modelo de cultivo de tejido in vitro para subsecuentemente ser expuesta a diferentes concentraciones de plomo y determinar si la misma es hiperacumuladora. Se estudiarán también en Bryophyllum pinnatum, genes asociados a la producción de proteínas que enlazan metales pesados, usando como referencia secuencias conservadas de metalotioneínas en Arabidopsis thaliana.

La especie Bryophyllum pinnatum se micropropagó asépticamente y se expuso a diferentes concentraciones de plomo por varios periodos de tiempo y mediante espectroscopia de absorción atómica de flama, se demostró que dicha planta es capaz de hiperacumular un 0.66 % de peso seco de Pb. En el nivel molecular, el mecanismo de hiperacumulación de Pb y otros metales pesados en plantas no se ha determinado, sin embargo, se sabe que proteínas como las metalotioneínas (MT’s) participan en la homeostasis de estos metales. En la especie Arabidopsis thaliana, estos genes han sido estudiados con mayor detalle, por lo que los mismos fueron la base para el diseño de las secuencias oligonucleotídicas de este estudio y permitieron identificar un segmento del genoma de Bryophyllum pinnatum compatible con secuencias publicadas de animales y plantas de genes de MT’s. A base de estos resultados concluimos que la especie Bryophyllum pinnatum es hiperacumuladora de Pb y presenta los genes de MT’s.

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El conocimiento de los mecanismos moleculares asociados a la toxicidad de los metales pesados en el nivel celular es limitado. Existen plantas capaces de tolerar altos niveles de metales pesados que ofrecen un buen modelo para estudiar la acumulación de metales pesados en la célula y al mismo tiempo representan alternativas de biorremediación. Las proteínas que enlazan metales, como el caso de las metalotioneínas (MT’s), han sido componentes importantes de la base molecular de la fitorremediación. Las MT’s son proteínas con un bajo peso molecular y alto contenido de azufre, presentes en procariotas y eucariotas. Estas proteínas han sido asociadas a la homeostasis, transporte y absorción de metales en plantas, sin embargo, su mecanismo de acción aún no es conocido.

Este trabajo conlleva el estudio de MTs en la planta tropical Bryophyllum pinnatum (conocida en Puerto Rico como Yerba Bruja). Análisis de MT’s y actina se han llevado a cabo en Bryophyllum pinnatum usando dos metodologías diferentes de extracción de proteínas: Nitrógeno líquido y un kit comercial; purificación utilizando la técnica SDS-PAGE e inmunodetección (Western blot). Estudios de bioacumulación de metales pesados en Bryophyllum pinnatum se realizan por otro grupo de trabajo en nuestro laboratorio, que indican que dicha planta representa un modelo ideal para estudiar la fitorremediación en el trópico. Ambas técnicas de extracción arrojaron buenos resultados; lo que nos llevó a concluir que su utilización dependerá de cuán rápido se requieren los resultados. La Inmunodetección reflejó la presencia de ambas proteínas en Bryophyllum pinnatum. La banda de actina fue notable en la membrana hidrofóbica (aprox. 60 KDa) y la banda de las MT’s fue detectada aproximadamente en los 8 KDa. Estos resultados caen dentro de los parámetros establecidos del peso molecular de actina y MT’s. Nos dirigimos a realizar un análisis de las metalotioneínas y actina en la planta Arabidopsis thaliana usando Western blot y relacionar los niveles de la proteína con la capacidad de la planta para sobrevivir en presencia de los metales pesados.

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El citoesqueleto en las plantas es una estructura intracelular dinámica que participa en múltiples procesos celulares y moleculares. La comprensión de la organización estructural y funcional del citoesqueleto de la planta, ofrece la posibilidad de relacionar directamente los mecanismos de movilización y asimilación de contaminantes tóxicos del ambiente. Esta pieza es un factor clave para el proceso de biorremediación de suelo, agua y aire, utilizando especies vegetales. La falta de conocimiento sobre el mecanismo molecular del citoesqueleto ha limitado su aplicación. Es necesario desarrollar herramientas específicas y estrategias para las células de las plantas, ya que la mayoría de los conocimientos actuales acerca del citoesqueleto de las plantas proviene de las células animales. El proyecto está centrado en un componente particular de la red de microfilamentos del citoesqueleto, la proteína miosina. La misma es el motor principal de proteínas, cuya interacción con la actina, es responsable de la mecánica de trabajo que impulsa a múltiples eventos intracelulares. Los datos preliminares utilizando anticuerpos heterólogos y Western blot, han indicado la presencia de esta proteína en los extractos de Arabidopsis thaliana. En esta investigación se han utilizado herramientas de bioinformática para desarrollar un anticuerpo policlonal en conejos. Hemos utilizando como antígeno un epítope sintético derivado de la miosina no muscular de la planta A. thaliana. El péptido antigénico que comprende un epítope de la región del ATP de miosina XI, fue diseñado utilizando herramientas de bioinformática y la información genética de Arabidopsis thaliana. También se diseñaron primers para realizar una amplificación mediante una Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR), con el fin de detectar la misiona XI y la actina en la planta A. thaliana.

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Las miosinas son proteínas contráctiles que, además de encontrarse en el tejido muscular, abundan en el citoesqueleto. Realizan una variedad de funciones asociadas a la motilidad celular. En el citoesqueleto de las células eucariotas, representan una variedad amplia de proteínas, las que se conocen comúnmente como miosinas no-musculares y participan en procesos esenciales como la citoquinesis y movilización de organelos celulares. Se han identificado más de veinte clases de miosinas, las cuales provienen mayormente de organismos de origen animal, así como de levaduras. En el caso de las plantas, su conocimiento es escaso. Nuestro interés primordial reside en caracterizar un anticuerpo policlonal que nos sirva de herramienta para estudiar las miosinas no-musculares en la planta Arabidopsis thaliana. Basado en otro trabajo realizado en nuestro laboratorio, se envió a sintetizar un epítope basado en la secuencia de miosina clase XI (MYA1) de Arabidopsis thaliana. La inmunización en conejos fue realizada por la Compañía GenScript, la cual nos ha provisto el suero que contiene el anticuerpo policlonal. Mediante ensayos de ELISA y extractos de Arabidopsis thaliana se ha caracterizado dicho anticuerpo.

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La fitorremediación es el uso de las plantas para acumular y remover metales o sustancias tóxicas del ambiente (Brooks et. Al. 1998). Según la teoría de Lacoste, uno de los factores importantes en la absorción de estos metales, en especies animales y vegetales, son los genes de Metalotioneína (MT’s). Estos genes se han encontrado en una serie de plantas como la Arabidopsis thaliana y otros organismos como Escherichia coli. Se interesa realizar estudios de estructura y función de las proteínas codificadas por estos genes, como parte de un esfuerzo para identificar plantas tropicales con posibilidades de remediar ambientes contaminados con metales pesados. La purificación tradicional de estas proteínas es un proceso poco eficiente, por lo que el objetivo principal de esta investigación es lograr expresar el gen de MT’s, utilizando la levadura Kluyveromyces lactis y el plásmido pKLAC1. Kluyveromyces lactis es una levadura que se ha utilizado extensamente como huésped para la expresión de proteínas heterólogas; es por esta razón, que nos interesa expresar el gen MT’s en dicha especie utilizando el plásmido pKLAC1. Para esto, se realizó un diseño experimental en donde la fase inicial estuvo basada en el estudio del comportamiento y desarrollo de la levadura. No obstante, simultáneamente se realizó una transformación utilizando la bacteria Escherichia coli para la creación de un banco de reservas para estudios futuros. Finalmente, utilizando las herramientas de bioinformática, diseñamos el modelo de clonación para la inserción del gen de MT’S en el plásmido pKLAC1. En un futuro, mediante la técnica de PCR, se amplificará el fragmento del gen de MT’s y mediante las técnicas de clonación se insertará en el plásmido pKLAC1, y por medio de la técnica de choque de calor se insertará en la levadura Kluyveromyces lactis. Lograr expresar el gen de MT’s en levadura, será un gran avance para acelerar el estudio de los mecanismos involucrados en el proceso de asimilación de metales por plantas.

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El citoesqueleto es una red tridimensional interconectada de microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios, que confiere estructura al citoplasma de una célula eucariota, e interviene en los movimientos celulares. El mismo, puede ser visualizado mediante inmunocitoquímica. El citoesqueleto interactúa en diversos procesos celulares y moleculares dinámicamente. La comprensión de esta organización estructural y funcional ofrece la posibilidad de relacionar directamente los mecanismos de asimilación de contaminantes tóxicos del ambiente. Este un factor clave para entender el proceso de asimilación de metales pesados por plantas fitorremediadoras. La falta de conocimiento sobre el mecanismo molecular del citoesqueleto, ha limitado y detenido el conocimiento científico, en cuanto a la movilización de los metales en las células vegetales. El conocimiento actual del citoesqueleto vegetal es escasamente limitado y todo el existente, proviene de las células animales. Las funciones del citoesqueleto dependen del arreglo y de la organización de los microtúbulos y microfilamentos, así como de su comportamiento y es modificado por las proteínas que se asocian directamente con los polímeros y sus subunidades de monómeros intactos. Es por ello, que en nuestra investigación se pretende realizar una calibración del método de inmunofluorescencia indirecta, utilizando la planta de Arabidopsis thaliana, para más adelante determinar si existe algún efecto degenerativo en el citoesqueleto de Bryophyllum pinnatum, cuando la planta se expone directamente a metales pesados. No obstante, actualmente hemos calibrado la técnica de inmunofluorescencia, el uso del micrótomo, la fijación del tejido vegetal a las laminillas y el uso del microscopio de fluorescencia.

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La planta Arabidopsis thaliana, es utilizada ampliamente en la investigación, con especial interés en la fitorremediación. No obstante, el generar esta especie in vitro mediante el uso de tejido diferenciado es trabajoso, por lo que se genera mediante el uso de semillas. Por esta razón, las especies generadas in vitro poseen una variabilidad genética predominante, por lo que los resultados que se obtienen son variables. A base de esto, la generación de callos de tejido diferenciado, es una alternativa de desarrollo de A. thaliana. A tales efectos, como propósito principal de esta investigación desarrollaremos e implementaremos la técnica de generación de callos de la A. thaliana con el fin de disminuir la variabilidad genética en una progenie de plantas. Este linaje generado, será utilizado en diversas experimentaciones de hiperacumulación de metales pesados como control. Además, iniciaremos el proceso de transformación de la especie, mediante la técnica de biobalística.

La técnica utilizada en esta investigación es la micropropagación vegetal de callos. Esta consiste en tomar un tejido diferenciado (hoja, raíz o tallo) de la especie generada in vitro, fragmentarlo y exponerlo al medio Murashige and Skoog Basal Medium (MS), con concentraciones de hormonas específicas que provocarán en las células vegetales un crecimiento no distintivo que formará la masa de células no diferenciadas. Luego, este tejido se colocará en un nuevo medio a diferentes concentraciones de hormonas las que estimularán la re-diferenciación de las células generando una nueva planta.

Por tanto, mediante esta experimentación se ha logrado desarrollar el tejido desdiferenciado, utilizando una combinación de hormonas de auxinas y citoquininas. Las auxinas provocan el desarrollo de las raíces, mientras que las citoquininas promueven el crecimiento de las hojas y los tallos. El balance adecuado en los reguladores de crecimiento incitará la diferenciación de las células dando paso a la nueva planta de A. thaliana. Para esta investigación se utilizó una combinación de Murashige and Skoog Basal Medium, Sucrosa, Myo-inositol y Tissue Culture Agar en conjunto con las hormonas, las cuales se añadieron a una concentración de 1mg/L, las mismas son: Indole-3 acetic acid (IAA), Napthtaleneacetic acid (NAA), 6-benzil-aminopurine (BAP) y 2,4-dichloro-phenoxyacetic acid (2,4-D). Al exponerse el tejido vegetal diferenciado a este medio, se estimuló la desdiferenciación del tejido, dando lugar al desarrollo de los callos. La aparición de estos es evidente a los cinco días de estar expuestos al medio en total oscuridad y a una temperatura constante. Después de cinco días, se colocaron en el anaquel donde están regulados los periodos de luz. Actualmente se está trabajando con la calibración de la concentración de hormonas que se debe añadir al medio para la re-diferenciación de las células vegetales y la formación de la nueva plántula de Arabidopsis thaliana.